1、提取方法

1)樣本研磨

2)將裝有樣品的離心管加入1 ml 65 ℃預(yù)熱的CTAB提取液和2%的巰基乙醇（如 果是動(dòng)物組織的話加50ul濃度為20mg/ml的蛋白酶K），在渦旋振蕩儀上震蕩混勻，使樣品完全懸浮，65 ℃烘箱溫浴40 -60min，不能超過(guò)1h

3)溫浴期間搖勻2-3次，保證裂解充分。取出后，冷卻至室溫

4)12000 rpm離心5 min，取上清液900ul至新的2.0 ml 無(wú)菌離心管中（。加入等體積三氯甲烷/異戊醇（24:1），上下顛倒混勻， 12000 rpm離心20 min

5)吸取上清液700 ul至新的2.0 ml 無(wú)菌離心管，加入等體積三氯甲烷-異戊醇 （24:1），上下顛倒混勻， 12000 rpm離心20 min

6)吸取上清液450 ul至新的1.5 ml無(wú)菌離心管中，加入上清液體積的2/3體積（300ul）的異丙醇和1/10體積（45ul）的3M乙酸鈉，充分混勻，-20 ℃放置1 h

7)12000rpm離心10min（如果從-20℃取出后絮狀沉淀較多，可12000rpm離心20s），棄上清，瞬時(shí)離心，用200ul槍頭吸棄多余液體

8)向沉淀中加1ml 75%的乙醇溶液，輕彈至沉淀懸浮，12000rpm離心5min，棄上清

9)瞬時(shí)離心，用黃槍頭吸棄多余液體，離心管開(kāi)蓋室溫晾干3-5min至DNA沉淀呈半透明狀

10)加入≥20 ul含10 ng/ul RnaseA的超純水，根據(jù)沉淀大小決定融水體積，溶解DNA沉淀，37 ℃水浴鍋消化1 h后保存在-20 ℃冰箱備用

注：常規(guī)植物組織提取正常使用CTAB提取，疑難植物（薔薇科等多糖類植物）組織裂解前使用干擾（清洗掉部分多糖等雜質(zhì)）先清洗，清洗完之后在加裂解液；動(dòng)物組織在裂解時(shí)加入2%的蛋白酶K；宏基因組項(xiàng)目提取在裂解時(shí)加入5%-10%的溶菌酶

2、檢測(cè)方法

2.1檢測(cè)方法

使用 Qubit（廠家YEASEN, 型號(hào)CAT 12642-A ，試劑1XdsDNA HS Assay kit for Qubit ）檢測(cè)核酸濃度，使用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)完整性

2.2判定標(biāo)準(zhǔn)

濃度≥1ng/ul

總量大于等于 30ng

完整性主帶清晰、主帶不清晰，主要彌散在2K以上，跳帶、或嚴(yán)重鋸齒狀、或“H”形或下方有非常嚴(yán)重的非RNA樣彌散等

核酸狀態(tài)正常

3、建庫(kù)方法

3.1基因組打斷

1)實(shí)驗(yàn)前，打開(kāi)冷卻循環(huán)組件上的溫控開(kāi)關(guān)，溫度設(shè)置為 4℃ , 使循環(huán)水降溫至 4℃

2)基因組打斷

A.取適量基因組 DNA（Qubit 定量）移入0.6mL進(jìn)口離心管，用1 ×TE補(bǔ)至總體積60μL（冰上操作）

B.按照對(duì)稱關(guān)系，將0.6mL進(jìn)口離心管放入0.65mL適配器，旋緊

C.根據(jù)片段大小按照相應(yīng)的打斷條件啟動(dòng)打斷

3)打斷產(chǎn)物的判斷

瞬時(shí)離心收集打斷產(chǎn)物，取 6ul 打斷產(chǎn)物電泳，檢測(cè)在相應(yīng)片段范圍內(nèi)主產(chǎn)物是否集中

4)打斷產(chǎn)物純化

A.將諾唯贊 DNA clean beads 提前 30min 室溫平衡備用

B.將剩余打斷產(chǎn)物轉(zhuǎn)入 1.5mL 離心管中，加入（1X）體積已混勻的磁珠，吹吸混勻

C.旋轉(zhuǎn)混勻儀上，室溫混勻，瞬時(shí)離心，而后置于磁力架上，靜置，移棄上清液

D.離心管置于磁力架上，向離心管中加入新鮮配制的 80%乙醇，磁力架上靜置 30s ，移棄上清液

E.重復(fù)步驟（4）一次，第二次清洗后，瞬時(shí)離心，用10 μL槍頭將上清液去除干凈

F.離心管置于磁力架上，打開(kāi)管蓋，室溫干燥至磁珠表面無(wú)光澤，有細(xì)微裂紋

G.取下離心管，加入0.1 ×TE ，吹吸混勻，室溫靜置，而后磁力架上靜置，吸取上清液轉(zhuǎn)入新的0.2mL PCR管中

3.2末端修復(fù)及加A

向上述純化產(chǎn)物中加入 End Prep Mix 4 ，混勻離心后放入 PCR 儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，立即進(jìn)行 接頭連接

3.3接頭連接

在上述反應(yīng)產(chǎn)物中加入 Rapid ligation Buffer 2 、接頭和連接酶，放入 PCR 儀中進(jìn)行接頭連接的反應(yīng)

3.4連接產(chǎn)物片段分選純化

1)向連接產(chǎn)物中加入一定體積的磁珠，充分混勻，室溫孵育后置于磁力架上，靜置，小心移除上清

2)向管中加入新鮮配制的 80%乙醇，磁力架上靜置 30s ，移棄上清液

3)重復(fù)步驟2一次，第二次清洗后，瞬時(shí)離心，用10μL槍頭將上清液去除干凈

4)反應(yīng)管置于磁力架上，打開(kāi)管蓋，空氣干燥，至磁珠表面無(wú)光澤，有細(xì)微裂紋

5)將反應(yīng)管從磁力架上取出，加入0. 1×TE洗脫DNA ，吹吸混勻，室溫靜置孵育，而后磁力架上靜 置，小心吸取上清至新的離心管中

6)吸取相應(yīng)體積 (0.6×)磁珠至步驟5的純化產(chǎn)物中，輕輕吹吸充分混勻，室溫孵育后置于磁力架上， 靜置，小心吸取上清液至新的離心管中，取相應(yīng)體積(0.15×)磁珠至上清液中，輕輕吹吸充分混勻，室溫孵 育后置于磁力架上，靜置，小心移除上清

7)向反應(yīng)管中加入新鮮配制的 80%乙醇，磁力架上靜置 30s ，移棄上清液，重復(fù)該步驟1次

8)打開(kāi)管蓋，空氣干燥至磁珠表面無(wú)光澤，有細(xì)微裂紋，加入0. 1×TE洗脫DNA ，吹吸混勻，室溫靜置，磁力架上靜置，小心吸取上清至新的PCR管中

3.5PCR 擴(kuò)增

1)加入PCR反應(yīng)所需的各種試劑，混勻，離心

2)根據(jù) PCR反應(yīng)條件，放入PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增

3.6PCR產(chǎn)物純化

1)瞬時(shí)離心 PCR 反應(yīng)管，加入相應(yīng)體積的磁珠，充分混勻

2)室溫孵育，然后置于磁力架上靜置，小心移除上

3)向反應(yīng)管中加入新鮮配制的80%乙醇，磁力架上靜置30s ，移棄上清液，重復(fù)該步驟1次

4)打開(kāi)管蓋，空氣干燥至磁珠表面無(wú)光澤，有細(xì)微裂紋，加入 ddH2O 洗脫DNA ，吹吸混勻，室溫靜置， 磁力架上靜置，小心吸取上清至新的1.5ml的離心管中，- 20℃保存?zhèn)溆?/p>

3.7文庫(kù)質(zhì)檢

1)質(zhì)檢方法：文庫(kù)通過(guò) Qsep-400進(jìn)行片段質(zhì)檢， 使用 Qubit 3 .0進(jìn)行文庫(kù)濃度的定量

2)質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)：濃度≥1ng/ul ，質(zhì)檢片段中心值 430-530bp ，平均值 420-580bp 之間，峰型呈正態(tài)分布，片段單一無(wú)雜峰

3.8引物接頭序列

adpter3=”AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC”;

adpter5=”AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT”;

3.9建庫(kù)試劑耗材

1)文庫(kù)構(gòu)建試劑盒：VAHTSTM Universal DNA Library Pren Kit ，貨號(hào) ND607-02

2)產(chǎn)物純化磁珠：VAHTSTM DNA Clean Beads， 貨號(hào)N411-03

3)質(zhì)檢使用試劑：Qsep400 標(biāo)準(zhǔn)DNA 卡夾

4)定量使用試劑：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml離心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen

3.10建庫(kù)設(shè)備

4、測(cè)序方法

測(cè)序設(shè)備：NovaSeq X plus

測(cè)序試劑盒：NovaSeqTMX? Series25B Rgt Kit